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配景：大多数肌肉骨骼毁伤是肌腱断裂。跟腱断裂的发病率约为每年每十万名患者18例。肌腱的愈合经过存在一些主要问题，举例与周围组织粘连和再次断裂。总体而言，即使领受最新的调整方法，肌腱也大多无法归附到运行功能。诸如血小板养殖助长因子 (PDGF-BB) 和胰岛素样助长因子 (IGF-1) 等助长因子在肌腱愈合经过中阐明着伏击作用，而肌腱愈合经过可能需要数月时刻。

方法：领受静电纺丝时间制备了由 Degrapol® (DP) 制成的团聚物管，将其敷用于断破绽合的肌腱上，以减少粘连形成，并通过将 IGF-1 和 PDGF-BB 掺入支架中来普及肌腱强度。领受扫描电镜 (SEM)、傅立叶变换红外光谱 (FTIR) 和差示扫描量热法 (DSC) 对团聚物管进行了表征。并评估了支架的水构兵角、力学性能和生物膜形成情况。领受ELISA法测定IGF-1和PDGF-BB的开释量随时刻的变化。用阿拉玛蓝(Alamar Blue)法测定IGF-1的生物活性，并用及时荧光定量PCR法测定第1天和第3天Col1、ki-67和腱周折卵白(tenomodulin)的基因抒发。

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东莞市富临塑胶有限公司是Degrapol在中国的代理商，富临塑胶为中国客户提供植入级可接纳聚氨酯Degrapol。

结果：助长因子开释能源学标明，PDGF-BB和IGF-1在领先4小时内呈爆发式开释，随后徐徐雄厚地开释长达42天。将助长因子(GF)掺入管中不会损害其机械性能，反而会改善其机械性能。添加1 ng/ml IGF-1可在第3天加多兔跟腱细胞中Col1的相对基因抒发。此外，与较高浓度的IGF-1（举例10 ng/ml和100 ng/ml）比较，第3天腱周折卵白和ki-67的抒发也有所加多。24小时后，不同制备支架之间的生物膜形成率未见显耀各别。

论断：制备并表征了含有IGF-1、PDGF-BB和两种助长因子(GF)的乳液电纺DP管。它们当今不错用于体内实验。咱们标明，添加GF对力学性能有积极的影响。IGF-1对细胞代谢莫得负面影响，而且在愚弄于兔肌腱细胞时加多了Col1、ki-67和肌腱周折卵白的基因抒发。基于这些结果，不错重迭制备生物活性管，并在肌腱断裂的体内模子中进行测试。

一、小引

01. 肌腱

肌腱组织是一种考究结缔组织，在发育经过中发源于腱节。腱节是体节中胚层的一个部分。硬骨素是一种伏击的转录因子，可指挥肌腱分化，这种分化由来自骨节和肌节的信号所引发。肌腱的基本结构框架由纤维状胶原卵白组成。它们被含有血管、淋巴管和神经的腱内膜包裹，形成束状结构。这些束状结构再被腱外膜包围，从而组成肌腱。肌腱由考究结缔组织组成，在机械负荷经过中起到将肌肉力量传递到骨骼的作用。肌腱包含细胞和非细胞因素。肌腱中数目最多的细胞是肌腱成纤维细胞，也称为腱细胞。它们的作用是产生胶原卵白并组织细胞外基质（ECM）。细胞外基质主要包含胶原卵白和水，还有一些额外的卵白聚糖和弹性卵白。I 型胶原卵白（Col1）是肌腱中主要的胶原卵白类型。I 型胶原卵白的交联进程在肌腱中部较高，此处的极限力也很高；而在肌腱与肌肉的贯穿处以及肌腱与骨骼的贯穿处，交联进程较低。一种称为腱外膜的滑膜包裹着通盘肌腱，并产生滑液，为细胞提供养分并匡助肌腱滑动。

02. 肌腱毁伤与愈合

大多数肌肉骨骼毁伤是肌腱断裂。尽管跟腱是东谈主体最健硕和最大的肌腱，但它亦然最常发生断裂的肌腱之一。跟腱毁伤主要发生在 30 至 60 岁、中等活动量的成年东谈主身上。对于潜水员、网球和篮球畅通员以及田径畅通员来说，跟腱断裂是一种常见的毁伤，因为跟腱承受着很大的压力。跟腱断裂的发病率约为每年每 10 万东谈主中有 18 东谈主。对于畅通员而言，跟腱毁伤的发生率在 6% 至 18% 之间，这导致大众约有 100 万畅通员碰到这种毁伤。男性比女性更容易受到影响。在文件中，报谈的男女比例从 2:1 到 12:1 不等。

肌腱的愈合可能需要长达数月的时刻。第一阶段是炎症阶段，正常在断裂后的第一周，其特征是存在中性粒细胞和巨噬细胞。随后是细胞增殖和树立阶段，可执续长达六周。在这个阶段，腱细胞千里积主要为 III 型胶原卵白的基质，肌腱肿胀，富含水分和卵白聚糖。肌腱愈合的终末阶段是重塑阶段，可能需要几个月的时刻。在这个阶段，细胞密度阻挡，III 型胶原卵白被 I 型胶原卵白取代。在肌腱愈合的树立阶段（第 5 - 14 天），助长因子（如血小板养殖助长因子 - BB（PDGF - BB）、骨形态发生卵白（BMP）、转动助长因子 β（TGF - β）、血管内皮助长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞助长因子（bFGF）和胰岛素样助长因子 - 1（IGF - 1））阐明着伏击作用。

肌腱愈合经过中最大的问题之一是与周围组织形成粘连，这会导致肌腱功能严重丧失。另一个严重问题是，由于在运行肌腱愈合经过中取得的机械强度不及，肌腱容易再次断裂。当然的肌腱愈合经过徐徐，这是由于神经主宰和血管化不及以及肌腱细胞的代谢率较低。未经手术调整，肌腱再次断裂的风险约为 40%，而通过手术可将风崎岖挡至 0.5%。机械负荷在肌腱愈合中起着伏击作用。过多的机械应力会导致再次断裂并减缓树立经过，而过度固定章会导致疤痕形成和与周围组织粘连，对树立产生负面影响。

归附受伤肌腱的运行脾性在实验方法中仍然是一个常见的烦嚣。当前，对于哪种方法最适当树立跟腱断裂仍存在凡俗揣测。保守调整正常会导致较高的再次断裂发生率，而手术侵扰则会带来更多并发症，如感染或深静脉血栓形成。最近对于肌腱断裂的揣测大多在测试不同的缝合方法，其中不可接纳缝线是缝合跟腱断裂的主要材料，因为东谈主们合计它在愈合经过中比可接纳缝线能提供更大的强度。到当前为止，对于断裂的肌腱有不同的缝合方法，但仅靠缝合无法王人备处理愈合经过中上述提到的问题。对于肌腱要害尺寸的缺损，往日曾使用过自体移植物、同种异体移植物和假体装配，但它们存在好多谬误。最近，揣测东谈主员勤奋于组织工程替代物、助长因子愚弄和基因移动等方法的揣测。在兔子动物模子中，一种有远景的方法是测试一种愚弄于断裂并缝合的跟腱上的 Degrapol（DP）管。DP 是一种生物相容性和可生物降解的共聚酯氨基甲酸酯，对肌腱愈合莫得不良影响。与仅使用 4 股贝克尔缝线比较，给缝合的兔子跟腱愚弄 DP 管在肌腱愈合早期露馅出与周围组织的粘连形成较少。DP 管是在受伤肌腱和腱周组织之间创建物理樊篱的有用方法，可将肌腱愈合部位的粘连形成减少约 20%。此外，这种愚弄不会阻挡生物力学性能或影响炎症反应。通过将团聚物管与另一层联接，在其中掺入血小板养殖助长因子 - BB（PDGF - BB），这一方法得到了进一步立异，因为在体内兔子模子中，由此产生的拉伸强度加多，且莫得指挥促纤维化效应。

03. Degrapol

DP 由两种不同的聚酯嵌段组成，其中一种是结晶性的（聚 - 羟基丁酸酯 - 共 - ε - 己内酯），另一种是柔滑的（聚己内酯 - 共 - 乙交酯）。这些部分不错以不同的分量百分比组合，从而产生不同的脾性。在本揣测中测试了三种不同类型的 DP，即 DP0、DP15 和 DP30（表 1）。揣测的主要部分使用 DP15，它含有 25% 分量的结晶性嵌段和 75% 分量的柔滑嵌段，以使手术操作愈加圣洁。与其他常用材料如聚（乳酸 - 共 - 酒精酸）（PLGA）或聚己内酯（PCL）比较，DP 具有更好的弹性性能。PCL 和 PLGA 的断裂应变比 DP 低。已知 DP 具有细密的细胞相容性，而且与细胞的相互作用不会引入任何细胞毒性作用或激活巨噬细胞。除了生物相容性外，DP 在体外也露馅出可生物降解性。DP15 是一种新配方，其脾性是弹性加多。经典的 DP30 含有 40% 分量的结晶性嵌段和 60% 分量的弹性嵌段。它们都不错通过水解进行生物降解。第三种材料 DP0 也由 40% 分量的结晶性片断和 60% 分量的弹性片断组成，但不可生物降解。翔实信息见表 1。

表1：不同 DP 块状材料的组成。DP15 被合计是更具弹性且可生物降解的 DP，DP0 为无弹性且不可降解的，DP30 为无弹性但可生物降解的。

生物可降解性是一个伏击方面，因为团聚物不错在体内降解，无需后续手术取出团聚物。DP 柔滑段中存在的乙交酰 - 乙交酯酯很容易水解，被视为薄弱要害。降解速率不错通过修改含有乙交酯和 ε - 羟基己酸酯的共聚酯二醇的序列结构来限度。通过将这些薄弱要害插入 DP 的无定形柔滑段中，不错已毕可控的生物降解性。在 37°C 的缓冲水溶液中，DP 的降解露馅，4 周后，平均分子量阻挡到 55%，12 周后达到运行分子量的约 25%。在体内实验中，当将经典的（DP30）和新的弹性 DP（DP15）愚弄于兔子跟腱 12 周后，均不雅察到了显耀的降解。

在先前的揣测中，还是测量了 DP 电纺网的内形状和外在面的滑动摩擦总共。电纺 DP 网的内形状滑动摩擦总共约低 20%，内形状更光滑。管的内形状是开始进行电纺的一侧，位于金属棒上。外在面则更简略。在体内模子中，将这种电纺管愚弄于跟腱时，会将管翻转，光滑的内形状面向周围组织，减少粘连，而较简略的外在面面向肌腱（图 1）。平坦内形状的单个纤维比外层的纤维更紧密地粘在一齐。这一事实有益于助长因子的开释，因为孔隙执政向肌腱的方进取更容易接近。助长因子可能比向周围组织更容易扩散到肌腱中。

图1：2mm 直径的 DegraPol（DP）管和 DP 垫。一段 1cm 长的 DP 管（A）；切成 1mm 圆片的 DP 管（B）；用于生物膜实验的垫，从直径 6mm、边长 1cm 的管上切下（C）；可见单根纤维的 DP 薄层（D）。植入后，管的内形状（面向周围组织）和外在面（面向肌腱）。

04. 助长因子

IGF - 1 是一种单链多肽，分子量为 7649 Da，它在伤口愈合的每个阶段都很伏击，在炎症和增殖阶段尤为要害。IGF - 1 的主要作用是刺激成纤维细胞的增殖和迁徙，并在重塑阶段加多细胞外基质中的胶原卵白和其他因素。反应振动创伤和机械负荷时，IGF - 1 卵白的抒发会加多。IGF - 1 不错通过刺激卵白质合成、加多细胞增殖、促进胶原卵白合成和减轻肿胀来镌汰归附时刻。IGF - 1 不错由助长激素（GH）指挥，也不错由机械信号指挥。当 IGF - 1 与其受体 IGF - 1 受体（IGF1R）联接时，不错激活三条路线：磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）/Akt 路线，导致细胞畅通和增殖；Ras - 丝裂原活化卵白激酶（MAPK）路线；以及磷脂酶 C（PLC）路线，后两条路线都导致细胞存活、DNA 和卵白质合成。

在多样揣测中，已标明 IGF - 1 在不同类型的组织中增强卵白质合成或细胞增殖等脾性。在骨骼肌中，IGF - 1 指挥细胞增殖和卵白质合成，而且在缺失契机产生负面影响。IGF - 1 加多骨骼中的骨矿物资密度。对于肌腱，揣测东谈主员发现，在患有指挥性肌腱病的马、健康的东谈主类肌腱以及工程化肌腱组织中，IGF - 1 都能加多胶原卵白的合成。当将外源性 IGF - 1 愚弄于大鼠树立后的跟腱时，DNA、胶原卵白和卵白聚糖的合成会增强，从而加速功能归附。在体外和体内条目下，使用 IGF1R 基因敲除模子时，揣测东谈主员不雅察到在 IGF - 1 作用下细胞增殖和卵白质合成的加多蔓延。但是，胶原卵白合成并未被 IGF - 1 指挥。如果与 PDGF - BB 联接，IGF - 1 可促进细胞增殖。PDGF - BB 是一种肝素联接助长因子，在体外和体内均可增强细胞增殖和基质合成。揣测标明，高浓度的 PDGF 可导致细胞增殖，而低剂量仅导致细胞迁徙。由于揣测东谈主员旨在使细胞在伤口部位平直增殖，而不是在组织部位，因此必须确保将助长因子导向伤口部位。在另一项揣测中，在绵羊肩袖上使用涂有 PDGF - BB 的缝线，论述露馅组织学评分有所普及，但愈合肌腱的机械性能并未改善。

助长因子在领先的 48 小时内会从愈合部位断根。为了优化 PDGF - BB 的结果，在运行的爆发式开释后，必须已毕执续徐徐且雄厚的开释。初度开释对于刺激细胞迁徙很伏击。在一项揣测中，通过基于纤维卵白 / 肝素的寄递系统予以 PDGF - BB 不错增强肌腱的滑动。电纺是一种制造直径在微米到纳米范围内纤维的方法。其他东谈主还是愚弄了不同的将助长因子掺入电纺家具的方法。揣测标明，乳液电纺是已毕恒定开释和可控开释模式的最圣洁方法。一种不太适当像助长因子这么卵白质的方法是将支架浸入含有生物分子的水相中，因为助长因子只会附着在形状，而不会掺入管中。乳液电纺的一个问题是掺入的生物分子可能由于变性而失去生物活性。为了克服这个问题，大鼠血白皙卵白（RSA）频繁用于卵白质 - 卵白质相互作用和雄厚。电纺纤维网更受深爱，因为它们具有高的形状积与体积比，这对于生物分子的负载和寄递是理念念的。好多因素，如电场强度、湿度、温度、职责距离和溶液的性质，都会影响纤维的厚渡过甚相互附着。为了增强肌腱的愈合经过，助长因子是一个伏击因素，它们周折细胞的代谢。它们通过与细胞形状受体联接并激活复杂的信号级联反应来阐明作用，从而导致细胞增殖、细胞分化和细胞外基质的产生。在本揣测中，助长因子 IGF - 1 和 PDGF - BB 被单独或组合掺入 DP 管中。

了解掺入的助长因子的开释能源学至关伏击。在肌腱愈合的情况下，助长因子的高运行开释（称为爆发式开释）很伏击，以便快速达到调整浓度。在随后的几天里，揣测东谈主员但愿已毕徐徐而雄厚的开释，以在数天内督察助长因子的合适浓度。爆发式开释的结果是使助长因子快速到达愈合部位，并在肌腱愈合的炎症阶段阐明作用。徐徐而雄厚的开释对于在树立阶段保执助长因子的存在很伏击，在这个阶段，基质正在构建，高细胞活性至关伏击。如果只消爆发式开释，助长因子会很快从愈合部位断根，因此促进作用会过早松开。乳化经过会影响掺入的助长因子的开释能源学和生物活性。由于助长因子的掺入，它们开始必须通过植入材料扩散，然后才能到达愈合部位，这会跟着时刻的推移阻挡开释量。揣测标明，添加形状活性剂和合适的超声振幅可在长达 7 天的时刻内普及 PDGF - BB 的开释量。

05. 生物膜

细菌等微生物很容易附着在不同的形状上并形成多细胞结构，称为生物膜。生物膜基质不错保护细菌免受周围环境的影响。生物膜的形成还可能导致多药耐药性，并影响手术器械的安全性和功能。因此，揣测东谈主员的支架不加多生物膜的形成相配伏击。金黄色葡萄球菌已知会在植入材料和宿主组织上形成生物膜，导致慢性感染。鼻腔定植正常发生在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株中，这会加多感染的风险。对甲氧西林敏锐的菌株（MSSA）的定植更为常见。葡萄球菌是革兰氏阳性球菌，金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的，而表皮葡萄球菌是阴性的。表皮葡萄球菌是常见的皮肤共生菌，会定植在植入装配上。金黄色葡萄球菌产生的卵白质可增强其与细胞外基质中常见的层粘连卵白和纤连卵白的附着。纤维卵白原是植入后最早附着在植入材料上的细胞外基质因素之一，因此会促进金黄色葡萄球菌生物膜的形成。纤维卵白原降解很快，但在植入较长时刻后会被纤连卵白取代。表皮葡萄球菌不与纤维卵白原联接，但大多数菌株也与纤连卵白联接。

在本揣测中，大多数菌株是革兰氏阳性菌。铜绿假单胞菌（PA）是独一用于测试的革兰氏阴性菌菌株。革兰氏阴性菌有一层薄的肽聚糖环绕，周围是外膜，而革兰氏阳性菌只消一层较厚的肽聚糖，因此形状结构不同。在先前的揣测中，揣测东谈主员发现银对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有抗菌作用。银纳米颗粒的抗菌结果高度依赖于其大小。正常，较小的颗粒尺寸对细菌菌株的抗菌结果会增强。沟通浓度的银愚弄于不同种类的细菌菌株时，可能会产生不同的结果。

06. 论文主义

本硕士论文的主义是制备并表征单独或组合负载 IGF - 1 或 PDGF - BB 的 DP 管。制备的管应可用于大鼠跟腱体内模子。因此，这些管的直径应为 2mm。这些管将被扬弃在大鼠模子中横断并缝合的肌腱上，通过向肌腱所在开释相应的助长因子来促进愈合经过，同期减少面向周围组织一侧的粘连形成。

二、材料与方法

01. Degrapol

为了合成不同的 DP 材料，将每种材料各部分按相应的分量百分比融化在 1,4 - 二氧六环中，并干燥至水含量低于 20ppm。将溶液冷却，加入化学计量的 2,2,4 - 三甲基己烷 - 二异氰酸酯（TMDI）。一天后，在 1 天内分 3 次加入二月桂酸二丁基锡（20ppm），以使 DP15 的分子量达到 100 - 110kDa，DP30 的分子量达到 60 - 100kDa。将团聚物在冷却的己烷异构体中千里淀，并用氯仿和硅胶 60 柱纯化，然后在冷却的酒精（EtOH）中千里淀。

02. 电纺溶液的制备

溶液的制备至少在电纺前一天进行。对于每个管，需要一种聚乙二醇（PEG，35kDa）溶液。该溶液通过将 1.5g PEG 和 3.5g 氯仿加入带螺旋盖的玻璃管中制备。DP 溶液通过将 DP15、氯仿和 1,1,1,3,3,3 - 六氟 - 2 - 丙醇（HFP）按照表 2 加入带螺旋盖的玻璃管中制备。对于最终版块的管，使用 12% 分量的 DP 溶液。为了掺入助长因子，还需要 12% 分量的 DP 溶液。

表2：测试的 DP 分量百分比溶液的组成。

03. 助长因子的掺入

对于 IGF - 1 的掺入，将 200μl 的 IGF - 1（10μg/ml IGF - 1，0.1% RSA，在 PBS 中）或 400μl 逐滴加入到 5g 的 DP 溶液中，同期在磁力搅动器上以 500rpm 搅动 5 分钟。然后在涡旋搀和器上须臾搀和。5g DP 溶液中 IGF - 1 的总量为 2μg 或 4μg。之后，将搀和物在超声浴中进一步乳化 15 分钟，然后再次在涡旋搀和器上须臾搀和。将乳液装入打针器中，立即用于电纺。对于 PDGF - BB 的掺入，领受沟通的次第。使用重组东谈主 PDGF - BB，将其在 0.1% RSA 的蒸馏水中稀释至浓度为 40μg/ml；将 200μl 这种溶液加入到 5g 的 DP 溶液中，导致每 5g DP 溶液中含有 8μg PDGF - BB。

04. 电纺制备支架

用于此主义的装配是平正的。它由一个直流高压电源、一个针座、传送装配和一个打针器泵组成。带有钝端的纺丝头包括一个由不锈钢制成的针头（内径 1mm，壁厚 0.3mm）。为了坐褥 DP 管，使用了 Euro Star B 旋转电机。笔据所需 DP 管的直径，将长度为 450 - 550mm 的金属棒安装到旋转电机上行为汇集器。用于大鼠动物模子的管直径为 2mm，用于机械测试和生物膜实验的管直径为 6mm。使用 5ml 玻璃打针器将 DP 溶液泵入纺丝头，打针器和纺丝头通过特氟龙软管贯穿（图 2）。

图2：电纺装配。从左到右：带有打针器的打针器泵（A）、贯穿到纺丝头的特氟龙管（C）、针座和传送器（E）、高压装配（F）、贯穿到旋转电机的金属棒（G） 。

制备 2mm 管的电纺条目为：流速 1ml/h，纺丝针头与金属棒之间的职责距离为 18.5cm，纺丝头与汇集器之间施加 12.5kV 电压，汇集器以 500rpm 的速率旋转。室温保执恒定（22 - 23°C），湿度在 25 - 35% 之间变化。运输 DP 溶液的针头握住向两侧横向出动，总出动范围为 20cm，以已毕团聚物纤维更均匀的漫衍。在每次电纺经过脱手时，套管和特氟龙管都要用氯仿清洗三次，并用空气吹洗三次。每根管的第一层是一层薄的 PEG，这是为了便于 DP 管的分离。将 PEG 溶液装入打针器并贯穿到特氟龙管，填充死体积。将打针器安装到泵上，流速设立为 5ml/h，直到纺丝头的针头出现第一滴溶液。然后将流速设立为 1ml/h，翻开针头传送装配、汇集器电机和高压。PEG 层的执续时刻取决于金属棒的直径，在纺丝头来去出动 1 - 3 次之间变化，绝顶于 1.5 - 4.5 分钟。装配按之前的方法清洗后，将 DP 溶液装入打针器。通盘溶液的制备经过沟通，但纺丝时刻不同。策动是总纺丝时刻约为 60 分钟，以取得预期的层厚度。

在本揣测中，制备了两层和三层的管。两层管包含一层 PEG，接着是普通 DP 溶液，顶部是含有助长因子（IGF - 1 或 PDGF - BB）和 RSA 的生物活性乳液 DP 溶液。三层管的第一层亦然 PEG，然后是普通 DP 层、含有 IGF - 1 的生物活性 DP 层，顶部是另一层普通 DP 层。对于同期掺入两种助长因子的管，其结构与其他三层管沟通，但第二层纯 DP 被含有 PDGF - BB 的乳液 DP 层取代。当管从金属棒上取下时，PEG 层被去除。

05. 样品储存

用移液器向 DP 管上添加 50% 酒精，将管从金属棒上取下。通过添加 50% 酒精，通盘管被浸湿，PEG 层融化，然后用镊子轻轻推拉即可取下管。这些管不错平直存放在干燥器中，或者先在 50% 酒精中清洗，再用蒸馏水冲洗，然后在干燥器中干燥。三到七天后，将管切成片断，存放在 36 孔板中，室温保存，以备后续使用。管的切割方式如图 3 所示，将 10mm、5mm 和 1mm 的管段放在 36 孔板的一个孔中，以笃定不同部位的脾性。

图3：切割暗示图。该图展示了从金属棒上取下并干燥后的管子切割方式。死守此决议以确保能笃定每个管段的位置。

06. Degrapol 支架中助长因子的掺入及开释能源学

为了测量 IGF - 1 和 PDGF - BB 在 DP 支架中的接纳情况，从管的两头各取三段 0.5cm 长的片断，再从中间取一段，分别放入单独的低联接微量管中。向每个管中加入 500μl 含 0.1% RSA 的 PBS 行为开释介质，在 37°C、300rpm 的条目下孵育。在各个时刻点，将介质移动到标记的微量管中，并向低联采选中补充崭新介质。开释样品储存在 - 20°C，直至进一步使用。IGF - 1 的开释量通过东谈主 ELISA 试剂盒按照制造商的决议进行定量，PDGF - BB 的开释量通过比色夹心东谈主 ELISA 试剂盒按照制造商的决议进行定量。使用 ELISA 微孔板读数仪在 450nm 波长下测量两种助长因子的掺入量，并以 570nm 行为波长雠校。测量值表露为随时刻的累积开释量（ng/ml）。孵育后，支架储存在剩余的 PBS 溶液中，于 - 20°C 保存。

07. 用阿拉玛蓝和定量团聚酶链反应评估生物活性

细胞培养：使用从新西兰白兔跟腱均分离的兔腱细胞。将腱细胞解冻并从新悬浮在含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 Ham's F12 培养基中。使用第 3 和第 4 代的腱细胞（图 4）。在 Ham's F12 培养基中，用阿拉玛蓝和定量团聚酶链反应（qPCR）测试 IGF - 1 的结果。测试浓度为 0、1、10 和 100ng/ml 的 IGF - 1 样品。

图4：兔腱细胞。呈纺锤形的兔腱细胞（A）；加入胰卵白酶孵育 10 分钟后呈圆形零散的兔腱细胞（B）。放大倍数：200 倍，比例尺 100μm。

用阿拉玛蓝测定细胞增殖：在第 1 天和第 3 天，通过阿拉玛蓝细胞活力测定法测定细胞增殖。将 350 个细胞 / 孔（时间重迭三次）加入 100μl 培养基中，移动到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳的条目下培养。为细心脱水，空孔中填充 PBS。将阿拉玛蓝溶液在细胞培养基中按 1:10 稀释，在细胞上孵育 4 小时，然后使用成像读数仪在激励波长 530nm、辐照波长 590nm 下测量。

及时定量 PCR：为了笃定 IGF - 1 对体外腱细胞基因抒发随时刻的影响，按照上述方法分离和培养兔腱细胞，并以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 6 孔板中，每孔加入 2ml 培养基。细胞过夜贴壁后，在第 0 天向培养基中加入所需浓度的 IGF - 1。在第 1 天和第 3 天汇集样品，使用来自肃清只动物的兔腱细胞，qPCR 实验重迭三次。在相当令刻点，使用 RNeasy Plus Mini Kit 试剂盒并进行无 RNase 的 DNase 处理，按照制造商的决议分离总 RNA。使用 Nanodrop One 测量 RNA 的纯度和含量。对于逆转录（RT），将 500ng RNA 加入 20μl 反应体系中进行反应，使用紧凑型热轮回仪。及时定量 PCR 反应使用所得 cDNA 4μl，在定量 PCR 仪上进行时间重迭三次，使用 Fast SYBR Green Master Mix。反应条目为：95°C 预变性 3 分钟，然后进行 40 个轮回，每个轮回包括 95°C 变性 3 秒、60°C 退火 20 秒。通盘引物合成序列见表 3。使用比较 2⁻ΔΔCT 方法，以 18S rRNA 行为内参基因进行相对抒发分析，结果以相对于未添加 IGF - 1 的对照样品（设为 1）的倍数变化表露。

表3：用于 qPCR 分析的引物序列。从这些基因测量抒发，列出 NCBI 参考序列（用作引物想象的模板）、扩增子大小以及正向和反向引物序列。

08. 生物膜

进行生物膜实验时，从电纺的纯 DP 或掺入 IGF - 1（每 5g DP 溶液含 4μg IGF - 1）的 6mm 管上冲切出 5mm 的圆片行为样品。部分纯 DP 圆片在含有 10nm 银纳米颗粒（浓度为 0.02mg/ml 的水性缓冲液）的蒸馏水中浸泡 24 小时，然后干燥。

通盘冲切的样品都放在培养皿中，在透风橱顶用紫外线映照 30 分钟进行灭菌。然后将样品放入 96 孔板中。生物膜实验分别使用 4 种或 10 种细菌菌株，所用菌株见表 4。

表4：用于生物膜测定的菌株。缩写阐述：MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MSSA：甲氧西林敏锐金黄色葡萄球菌，MRSE：耐甲氧西林表皮葡萄球菌，VRE：耐长时霉素肠球菌，CI：临床分离株，ATTC：好意思国典型培养物收藏中心，VA：VASGRA 分离株。

将细菌菌株用崭新 PBS 制备并稀释至光密度（OD）为 0.5，再将该溶液在所需培养基（Ham's F12 + 10% BSA 或 RPMI + 10% FCS）中按 1:200 稀释。将 200μl 制备好的细菌悬液加入到含有样品的 96 孔板的每个特定孔中，每个菌株和时刻点设立 2 个样品。将平板在 37°C 下静态孵育 1 小时和 24 小时，之后进一步处理并在 37°C 下再孵育 18 小时，然后计数菌落数目。更多信息见补充实验决议。

09. 扫描电子显微镜（SEM）

对于每根管，从管的中部、左侧和右侧取样。管的制备有四种不同方法。开始，用手术刀切下 1mm 的管段形成小环（切割部位）。为了取得访佛的不雅察视角并使内壁结构可见，借助液氮和镊子将管撅断。为了分析内形状和外在面，用手术刀将管切开并切成小块。将小样品用导电双面胶固定在 SEM 样品台上，必要时用移液器吸头固定样品。涂层和成像由苏黎世大学显微镜和图像分析中心的开采完成，样品用溅射镀膜仪镀上 10nm 的铂膜，使用 SEM 在 5kV 高压下进行检讨，以 507 倍放大倍数、49% 亮度拍照，探伤器设立为二次电子模式。使用 ImageJ 软件，笔据显微镜图像的比例尺测量纤维直径和管壁厚度。

为了标准化管壁厚度的测量，领受时钟刻度的决议，分别在 2 点、4 点、6 点、8 点、10 点和 12 点位置拍摄 SEM 图像，从每张图像中立地中式 5 个点进行测量。对于纤维直径的测定，每个样品按图 5 所示拍摄 3 - 5 张图像。在每张 SEM 图像上画一条对角线，测量与对角线相交的通盘纤维或孔隙在相交点处的尺寸。

图5：用于分析层和纤维参数的图像漫衍。扫描电子显微镜（SEM）图像展示了 DP 管切割部位（A）和外在面（B）的概况。红色方块代表从一个样品中获取的单个图像的漫衍。测量基于这些视线（FOVs）。（A）放大倍数 87 倍，比例尺 200μm；（B）放大倍数 86 倍，比例尺 200μm。

笔据管的测量数据和分量，按照图 6 所示谋划管的密度和单元面积分量。谋划内半径时使用金属棒的直径，谋划外半径时将层厚度加到内半径上。

图6：用于谋划的管暗示图。笔据管的测量数据和分量谋划密度和单元面积分量。绿色表露内半径（使用金属棒的直径），蓝色表露外半径（内半径加表层厚度） 。

谋划方法如下：

形状积（cm²）= 内半径（cm）×π× 管长（cm）

体积（cm³）=π× 管长（cm）×（外半径（cm） - 内半径（cm））²

单元面积分量（mg/cm²）= 分量（mg）÷（2× 内半径（cm）×π× 管长（cm））

密度（mg/cm³）= 分量（mg）÷（π× 管长（cm）×（外半径（cm） - 内半径（cm））² ）

10. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

傅里叶变换红外光谱分析在配备有 Golden Gate - 金刚石 ATR 附件且可限度温度的傅里叶变换红外光谱仪上进行。光谱采集范围为 600 - 4000cm⁻¹，分辨率设立为 4cm⁻¹。为取得光谱，对 64 次扫描进行平均。为了进行比较，谋划 1720cm⁻¹ 处 C = O 峰与 1175cm⁻¹ 处 C - O 峰的比值。为直不雅呈现数据，将数据归一化到 1720cm⁻¹ 处的 C = O 峰。分别对 DP0、DP15 和 DP30 粉末，以及纯 DP15 管和不同的乳液 DP15 管进行评估。还测量了 PEG，以检讨 PEG 溶液是否通过洗涤王人备去除。通过将峰与红外光谱表对比，评估相应的化学键。

11. 差示扫描量热法（DSC）

使用差示扫描量热仪对样品进行热分析。样品的加载量在 3 - 15mg 之间，热谱图的测量范围为 - 90°C 至 170°C，加热和冷却速率为 10°C/min。汇集两个加热轮回和一个中间冷却轮回的数据，仅使用第二个加热轮回的数据进行不相似品的比较。对 DP0、DP15 和 DP30 粉末，以及纯 DP15 管和不同的乳液 DP15 管进行评估，同期测量 PEG 以检讨 PEG 溶液是否通过洗涤王人备去除。通过 DSC 的次第谋划玻璃化更动温度和相变焓。

12. 静态水构兵角

测量纯 DP15 管和含 IGF - 1 的 DP15 乳液管的水构兵角。样品制备时，用手术刀切开管，将内层朝上放在用双面胶带准备好的载玻片上。使用滴形分析仪测定水点与管形状形成的角度，设立滴体积为 10μl。将样品放在装有超纯水的 1ml 打针器下方，滴一滴水在形状（图 7）。仪器平直测量水点与形状形成的摆布角度，取其平均值并从 180° 中减去，得到水构兵角。每个样品至少测量四次。

图7：静态水构兵角的评估。DP 管内形状的水点（A）；蓝色表露基线，绿色表露角度 α，水构兵角 β = 180° - α（黄色）。测试装配（B），装有水的打针器位于支架上方，支架可出动以在形状添加更多水点。

13. 支架的机械测试

使用纯 DP15 管和含 IGF - 1 的乳液 DP15 管进行机械性能测量。使用单轴载荷测试机测量应力 / 应变弧线，通过从 6mm 管上切割出 2mm×18mm 的矩形试样来测量轴向和横向所在的性能，样品夹紧的标距长度为 10mm。对于管的测量，将管切成 2mm 的片断，夹紧标距长度为 8mm，测量暗示图见图 8。纯 DP 管的厚度为 434μm（±21μm），含 IGF - 1 的 DP 管厚度为 687μm（±84μm）。由于样品厚度不同，仅评估和比较材料脾性。对通盘样品施加 10mm/min 的应变速憨直至样品失效，测量形状应变（%）、拉伸力（N）、试样宽度（mm）和层厚度（mm），并笃定每个条目下的断裂应变（%）、极限拉伸应力（MPa）和杨氏模量（MPa）（n = 6）。

图8：机械测试装配。轴向和横向拉伸测试的设立（A、B）；环形拉伸测试（恣意状态（C）和拉伸状态（D））。红色表露标距长度，轴向、横向为 10mm，管测试为 8mm。

14. 统计学分析

数据使用 GraphPad Prism 9 软件进行分析。使用 Shapiro - Wilk 锻真金不怕火来锻真金不怕火数据的正态漫衍。对于两组数据的比较，如果数据呈正态漫衍，则使用非配对 t 锻真金不怕火；不然，使用 Wilcoxon 锻真金不怕火。对于多组数据的分析：若数据呈正态漫衍，领受单因素方差分析（ANOVA）并联接 Tukey 多重比较锻真金不怕火进行两两比较；对于分组分析，使用双因素方差分析，并联接Šídák 或 Tukey 多重比较锻真金不怕火进行两两比较。若数据顽抗从正态漫衍，则使用非参数 Kruskal - Wallis 锻真金不怕火。p≤0.05 被合计具有统计学兴趣，标记为（*）；p≤0.01 标记为（**）；p≤0.001 标记为（***）；p≤0.0001 标记为（****）；无统计学兴趣标记为（ns）。标准弧线的谋划和其他谋划在 Excel 软件中进行。

三、结果

01. SEM

图 9 中的 SEM 图像判辨地露馅了相互层叠的单个纤维汇集。不错看出，纤维的大小和形态存在各别。图像还展示了管的内形状和外在面之间的彰着各别。在管的外在面（图 9A），愚弄时该形状面向肌腱，可见好多单个纤维交融形成的凹槽，这些凹槽有助于在将管愚弄于肌腱时使其固定在位。管的内形状（图 9B）在愚弄时面向外部组织，纤维是扁平的，这有助于在愈合经过中最小化组织粘连。切割部位与断裂部位比较，有更多交融的纤维，这是由于用手术刀切割支架时施加的力导致的。

图9：通过 SEM 取得的 DP + IGF - 1 管的形状结构。图像拍摄条目为放大倍数 507 倍、二次电子探伤器、亮度 49%。外在面（A）、内形状（B）、切割部位（C）、断裂部位（D），比例尺 30μm。

02. 单元面积分量和密度

不相似品的单元面积分量各别较大（图 10），而密度在样品之间似乎更为一致。在密度方面，仅在含 5 倍 RSA 的 IGF - 1 管与 PDGF - BB 管 1 以及同期含两种助长因子的 DP 管之间不雅察到显耀各别。单元面积分量的主要各别存在于三种含 IGF - 1 的 DP 样品与含 PDGF - BB 的样品之间。除 DP - IGF - 1 - T2 外，含 IGF - 1 的管正常比其他管的层厚度更低。

图10：不同 DP15 管的单元面积分量和密度比较。该图展示了各管通盘长度上单元面积分量的各别（A）。每根管笔据长度进行 3 至 12 次测量。单因素方差分析露馅均值之间存在显耀各别（p < 0.0001）。各管的密度（B），每根管从中间部分和两头各取一个样品。方差分析露馅密度均值之间存在显耀各别（p = 0.0258）。Tukey 多重比较锻真金不怕火标明 DP - IGF1 + 5xRSA 与 DP - PDGFBB - T1 和 DP - PDGFBB - IGF1 之间存在显耀各别。数据以箱线图表露，包含四分位数间距和 95% 置信区间。

03. 纤维直径

如图 9 的 SEM 图像所示，单个纤维的直径不同，范围在 2 - 18μm 之间，每根管的平均直径约为 5μm。比较通盘类型的管，内形状的纤维直径似乎更为一致。在内形状纤维方面，仅含 IGF - 1 的 DP 管与含 PDGF - BB 的 DP 管之间存在显耀各别（图 11）。在外在面，同期含两种助长因子的 DP 管与仅含 PDGF - BB 的 DP 管以及普通 DP 管之间存在显耀各别；普通 DP 管与含 IGF - 1 的 DP 管之间也有显耀各别；含 IGF - 1 的 DP 管与含 PDGF - BB 的 DP 管之间相似存在显耀各别。

图11：纤维直径。比较不同管子在内形状和外在面的纤维直径。每根管使用 5 至 9 个视线（FOVs）测量纤维厚度。对每个形状进行非参数 Kruskal - Wallis 锻真金不怕火以笃定中位数各别的显耀性（内形状 p = 0.0011，外在面 p < 0.0001）。数据以箱线图表露，包含四分位数间距和 95% 置信区间。

04. 机械测量

进行了三种不同类型的拉伸测试。轴向拉伸是指片断沿管的所在拉伸，横向和环形拉伸的所在沟通，即垂直于管的所在。

与纯 DP 管比较，乳液管在通盘三个拉伸方进取的断裂应变（%）均显耀加多（图 12A），轴向所在的各别最大，断裂应变加多了 2.0 倍。在断裂应变方面，轴向所在的值高于环形和横向所在。

图12：机械测量。每个所在和每种材料的断裂应变（%）（A）、极限拉伸应力（MPa）（B）和杨氏模量（MPa）（C）。比较每根管的轴向、横向和环形拉伸（D）。拉伸所在的图示（E）。数据以平均值和标准差表露，并露馅单个数据点。使用 Kolmogorov - Smirnov 锻真金不怕火比较断裂应变，通盘三个所在的 p = 0.0022（A）；对每个参数使用非配对 t 锻真金不怕火分析数据，通盘三个所在的极限拉伸应力 p < 0.0001（B），轴向杨氏模量 p < 0.0001，横向 p = 0.0030，环形 p = 0.0005（C）；使用单因素方差分析和 Tukey 多重比较锻真金不怕火分析数据（p < 0.0001）（D）。

与 DP 比较，含 IGF - 1 的 DP 支架在通盘三个方进取的极限拉伸应力（UTS，MPa）均显耀加多（图 12A、B、C）。在轴向方进取，乳液支架的 UTS 比纯 DP 支架加多了 2.4 倍（图 12B）。在乳液管中，轴向所在的 UTS 比横向所在加多了 2.2 倍，轴向拉伸的结果也显耀高于横向环形拉伸（图 12D），纯 DP 管也有沟通的趋势。

乳液电纺支架在通盘三个拉伸方进取的杨氏模量（MPa）均显耀高于纯支架。在轴向方进取，乳液与纯 DP 比较，杨氏模量加多幅度最大，达到 1.4 倍（图 12C）。与其他测量所在一样，轴向所在的杨氏模量高于环形和横向所在。

总体而言，在通盘测量中，环形和横向拉伸之间莫得显耀各别。失效模式主如若试样扯破，而不是在夹紧部位扯破。

05. FTIR

DP 的 FTIR 光谱在 1720 cm⁻¹ 处露馅出一个相配强的峰，该峰与 C=O 键联系（图 13）。这些键是 DP 中聚氨酯键的主要部分，如图 13C 所示。在 PEG 的光谱中，该峰不可见（图 13A），因为 PEG 中不存在 C=O 键（图 13D）。PEG 最强的峰出当今 1095 cm⁻¹ 处，与 C - O 键联系。这个峰在 DP 中也存在，因为这两种物资都含有好多此类键。在两种光谱中都有几个其他峰，分别对应 C - H 或 O - H 键，还有对应 DP 结构的 N - H 和 N - O 键，这些键在 PEG 中未出现。2365 cm⁻¹ 和 2330 cm⁻¹ 处的双峰对应 CO₂的键合，属于配景噪声。

图13：FTIR 光谱的峰分析。PEG 的 FTIR 光谱归一化到 1095cm⁻¹ 处的 C - O 峰，峰标注了相应的波数和化学键（A）；DP15 的 FTIR 光谱归一化到 1720cm⁻¹ 处的 C = O 峰，峰标注了相应的波数和化学键（B）；DP 的化学结构，有两个 R1 和 R2 基团（C）；PEG 的化学结构（D）。

比较 DP15、DP0 和 DP30 的粉末与由 DP15 制成的管，通盘样品的 FTIR 光谱莫得彰着各别（图 14A）。但是，在差示扫描量热法（DSC）中不雅察沟通样品时，发现 DP15 粉末和 DP15 管与 DP0 和 DP30 之间在热流方面存在彰着各别（图 14B）。DP15 粉末在约 135°C 处仅露馅一个峰，而 DP0 和 DP30 粉末在约 135°C 和 140°C 处露馅两个峰。DP15 管与 DP15 粉末有相似的峰，但在约 55°C 处还有一个额外的峰。DP15 是新的弹性材料，其弹性与非弹性部分的比例高于 DP0 和 DP30。通盘样品的玻璃化更动温度都在沟通区域，介于 - 45°C 和 - 35°C 之间。

图14：不同 DP 分量百分比和管的比较。比较 DP0、DP15、DP30 的粉末和由 DP15 制成的管。FTIR 光谱在 600 - 4000 范围内，光谱归一化到 1720 cm处的 C = O 峰（A）；DSC 第二次加热轮回在 - 80°C 至 170°C 范围内，数据以归一化热流露馅（B）。

比较两种不同的洗涤方法，并与 DP15 粉末和 PEG 进行对比，以确保最终的管中莫得残留 PEG（图 15A）。标记为 “正常洗涤” 的管是之前使用但为后续管子进行了调整的方法，即通过添加 50% 酒精从金属棒上取下 DP 管。“额外洗涤” 表露管子分别用 50% 酒精和蒸馏水洗涤，然后干燥。在 FTIR 中，三种不同 DP 样品的峰漫衍模式莫得彰着各别。在 DSC 图（图 15B）中，正常洗涤的管与其他两种 DP 管之间存在各别。正常洗涤的管在约 55°C 处出现一个小峰，PEG 也在此处有峰，该峰表露用于相变的焓。

图15：不同洗涤方法的比较。“正常洗涤” 指用 50% 酒精融化 PEG 层后立即储存，“额外洗涤” 指管子另外用 50% 酒精洗涤并用蒸馏水冲洗。FTIR 光谱在 600 - 4000cm⁻¹ 范围内，光谱归一化到 1720cm⁻¹ 处的 C = O 峰（A）；DSC 第二次加热轮回在 - 80°C 至 170°C 范围内，数据以归一化热流露馅（B）。

当比较单个管子时（图 16A），FTIR 光谱的峰漫衍模式莫得彰着各别。但是，在 DSC（图 16B）中，一些管子在约 55°C 处出现一个峰，而 PEG 正常在此处有峰，该峰的肇端温度表露相变的肇端温度。这些峰仅出当今正常 DP 管、含 IGF - 1 的 DP 管 1 以及含 PDGF - BB 的 DP 管 2 上一个相配小的峰。DP 和含 IGF1 - T1 的管是早期制备的，仅用 50% 酒精洗涤，而其他管子还经过了另一次 50% 酒精浴和蒸馏水洗涤。通盘样品的玻璃化更动温度仍在沟通区域，再次介于 - 45°C 和 - 35°C 之间。

图16：单个管子的比较。展示不同制备管子的光谱。测量结果按管子类型分组，用相应方式表露。FTIR 光谱在 600 - 4000cm⁻¹ 范围内，光谱归一化到 1720cm⁻¹ 处的 C = O 峰（A）；DSC 第二次加热轮回在 - 80°C 至 170°C 范围内，数据以归一化热流露馅（B）。DP 表露 DP15，T 表露管子。

对于通盘 FTIR 光谱，测定了 C=O 与 C - O 的峰强度比。将 1720 cm⁻¹ 处 C=O 键的透射值除以 1095 cm⁻¹ 处 C - O 峰的透射值。比较两种经典材料与新的弹性材料时，发现有在显耀各别，而两种经典 DP 版块之间莫得显耀各别。通盘含有新弹性 DP 版块的样品之间也莫得显耀各别。对于新弹性样品，该比值约为 1.5，而两种经典材料的比值则高 0.5，约为 2（图 17）。

图17：C = O 与 C - O 峰的比率。将 1720cm⁻¹ 处 C = O 峰的透射值除以 1095cm⁻¹ 处 C - O 峰的值得到该比率。数据以平均值和标准差表露。DP0 和 DP30 之间无显耀各别，但它们分别与其他通盘样品有显耀各别。为简化表露，用箭头和相应显耀性标注。使用普通单因素方差分析（p < 0.0001），Tukey 过后多重比较锻真金不怕火露馅各别高度显耀。T 表露管子。

06. DSC

测量了不同管子和块状材料的玻璃化更动温度（°C）。比较经典材料与新弹性材料时，发现玻璃化更动温度莫得各别（图 18A），相变焓亦然如斯（图 18B）。即使之前一些样品在 PEG 正常出现峰的位置露馅出小峰，但各别似乎较小。PEG 的平均相变焓（170.9 J/g）比其他样品（DP30：21.7 J/g，DP15 - PDGFBB - IGF1 - T：4.8 J/g）高 7.9 至 35.6 倍，这标明 PEG 发生相变需要比 DP 多得多的能量。由于样本量太小，无法检测到显耀各别，但不错不雅察到相变焓有升高的趋势。

图18：用 DSC 分析玻璃化更动温度和焓。每个条目下玻璃化更动温度（°C）的平均值和标准差（A）；通过熔化经过生成的弧线底下积谋划相变焓，每个条目下相变焓（J/g）的平均值和标准差（B）。未露馅标准差的地方仅测量了一个样品。对两者均愚弄 Kruskal - Wallis 非参数锻真金不怕火，并给出相应 p 值；（A）中 p = 0.3709，（B）中 p = 0.6202。T 表露管子。

07. 水构兵角

仅对两种样品类型谋划了水构兵角，即纯 DP15 和含 IGF - 1 的 DP15，后者代表通盘乳液电纺管。纯 DP15 管的平均水构兵角（88.9°±2.97°）比含 IGF - 1 的 DP15 管（114.9°±3.90°）小 1.3 倍（26°）（图 19）。两种管都只消一层，分别是纯 DP 或含 IGF - 1 的乳液 DP。测量是在水点滴在管的内形状后立即进行的。

图19：纯 DP15 和含 IGF - 1 的 DP15 管的水构兵角。笔据每次测量的摆布角度谋划平均角度。数据以箱线图表露，包含四分位数间距和 95% 置信区间，纯 DP15 管 n = 11，含 IGF - 1 的 DP15 管 n = 7。使用非配对 t 锻真金不怕火分析数据，p < 0.0001。

08. 生物膜

比较了三种不同类型的支架对四种临床分离细菌菌株的生物膜形成情况（图 20A）。测量每毫升的菌落形成单元（CFU），发现不同支架材料对每种菌株的生物膜形成莫得显耀各别。PA2 菌株在纯 DP 支架和含 IGF - 1 的 DP 支架上形成的 CFU/mL 数目比其他菌株高。对于纯 DP 和含 IGF - 1 的 DP，比较了十种不同的菌株，以涵盖更多非临床分离菌株。在这个实验中，莫得发现显耀各别。对于 SA1 菌株，纯 DP 的 CFU 比含 IGF - 1 的 DP 低 10 倍。

图20：在 RPMI（10% FBS）中培养 1 小时和 24 小时后的生物膜形成情况。结果露馅每种测试菌株的log 10周折后的每毫升菌落形成单元（CFU）。在三种不同支架材料（纯 DP、含 4mg IGF - 1 每 5g DP 溶液的 DP - IGF - 1 和在 0.02mg/ml 水性银溶液中浸泡 24 小时的 DP - Ag）上比较四种菌株（A）；对纯 DP 和含 IGF - 1 的 DP 比较十种菌株 24 小时的生物膜形成情况（B）。对每种菌株使用 Kruskal - Wallis 锻真金不怕火和 Dunn 多重比较锻真金不怕火进行支架间的两两比较（A）；对每种菌株使用 Kolmogorov - Smirnov 锻真金不怕火比较支架（B）。未露馅出显耀各别。SA：金黄色葡萄球菌，SE：表皮葡萄球菌，EA：粪肠球菌，PA：铜绿假单胞菌，更多翔实信息见表 4。

09. 开释能源学

含 0.25% RSA 的管子在四天内露馅出最高的累积开释量，为 9.2 ng/mL（±1 ng/mL）。含 0.5% RSA 的管子在四天内的累积开释量比 0.25% 的管子低 1.5 倍。0.1% RSA 的管子（1.2 ng/mL ±0.9 ng/mL）和 0.5% RSA 的管子（1.7 ng/mL ±0.2 ng/mL）在 1 小时后的运行爆发开释量相似，但对于 0.5% RSA 的管子，开释量在后续仍执续加多，而 0.1% RSA 的管子在 1 小时后的时刻点开释量相配小（图 21）。统计露馅，0.25% RSA 的管子在 1 小时后的开释量显耀高于 0.1% RSA 的管子（p = 0.003）和 0.5% RSA 的管子（p = 0.0045）。在第 1 天和第 2 天，仅 0.25% RSA 的管子与 0.1% RSA 的管子之间存在显耀各别，p 值分别为 0.0095 和 0.0215，在后期时刻点莫得显耀各别。

图21：不同 RSA 浓度对助长因子随时刻开释的影响。该图展示了 IGF - 1 在 4 至 7 天内的开释情况。每条彩色线代表一种不同的三层管，其独一区别是 DP15 IGF - 1 乳液溶液中 RSA 的浓度。每个条目每个时刻点测量三个重迭样本。结果以平均值和标准差表露。对每个时刻点进行单因素方差分析和 Tukey 多重比较锻真金不怕火。

在比较储存条目时（图 22），从肃清根管上取下不同的管段，分别平直分析或在室温（RT）下储存 10 个月或在 - 20°C 下储存后分析。开释能源学标明，崭新制备的管子随时刻的累积开释量更高，在每个相当令刻点开释的 IGF - 1 也更多。崭新管子的爆发开释量为 17.7 ng/mL（±3.6 ng/mL），是在 - 20°C 下储存的管子（7.1 ng/mL ±5.9 ng/mL）的 2.5 倍。在室温下储存 10 个月的管子运行爆发开释量仅为 0.2 ng/mL（±0.2 ng/mL），比崭新管子低 88.5 倍。崭新管子在三天内的累积开释量为 36 ng/mL（±7.2 ng/mL），在 - 20°C 下储存的管子为 13.7 ng/mL（±2.2 ng/mL），在室温下储存的管子为 3.5 ng/mL（±1.6 ng/mL）。由于样本量太小，莫得露馅出显耀各别。

图22：生物活性 DP 管的存储方法对开释能源学的影响。图示为肃清 DP 管中 IGF - 1 随时刻的开释弧线。红色表露管子坐褥后平直测量的开释情况，绿色表露在 - 20°C 储存 10 个月后的 IGF - 1 开释情况，蓝色表露在室温下储存 10 个月后的 IGF - 1 开释情况。数据以平均值和标准差表露。对每个时刻点进行 Kruskal - Wallis 锻真金不怕火和 Dunn 多重比较锻真金不怕火。

两种助长因子的开释能源学均露馅在领先 1 小时内有爆发式开释，随后 PDGF - BB 呈徐徐雄厚开释，IGF - 1 也有访佛开释，可执续长达 42 天（图 23）。IGF - 1 的运行爆发开释量为 913 pg/mL（±572 pg/mL），是 PDGF - BB（187 pg/mL ±66 pg/mL）的 4.9 倍。42 天后，IGF - 1 的累积开释量为 1993 pg/mL（±965 pg/mL），而 PDGF - BB 的开释量为 688 pg/mL（±210 pg/mL）。领先乳化到管中的 IGF - 1（4μg）量是 PDGF - BB（8μg）的一半。在每个时刻点比较开释量时，莫得发现统计学各别。

图23：同期掺入 PDGF - BB 和 IGF - 1 的管子的开释能源学。开释能源学露馅 IGF - 1 总体开释量较高，但标准差也较大。开释能源学标明部分助长因子执续开释至第 42 天。在每个相当令刻点使用非配对 t 锻真金不怕火。

10. IGF - 1 对兔跟腱腱细胞的补充及生物活性

在两个不同时间点，即第 1 天（图 24A）和第 3 天（图 24B），评估了两种肌腱标记物 Col1 和腱调卵白以及增殖标记物 ki - 67 的抒发。相对基因抒发以对照组为标准进行归一化。发现了一些各别。在第 3 天，1 ng/mL 的 IGF - 1 处理组中 Col1 的相对抒发量显耀高于通盘其他浓度组。腱调卵白在 1 ng/mL IGF - 1 处理组中的抒发也显耀高于其他浓度组。ki - 67 在 1 ng/mL IGF - 1 处理组中相似加多。

图24：IGF - 1 补充后第 1 天（A）和第 3 天（B）Col1、ki67 和腱调卵白的基因抒发。对 Col1 和腱调卵白使用 ANOVA 和 Tukey 多重比较锻真金不怕火，对 ki67 使用 Kruskal - Wallis 锻真金不怕火和 Dann 多重比较锻真金不怕火。星号表露多重比较的 p 值。

阿拉玛蓝实验在各个时刻点不同浓度之间莫得露馅出显耀各别（图 25）。在通盘浓度下，第 0 天和第 1 天之间莫得显耀各别，但在第 3 天，通盘浓度组的细胞数目与第 0 天和第 1 天比较均显耀加多（p < 0.0009）。

图25：通过阿拉玛蓝评估的细胞数目随时刻的变化。该图展示了不同 IGF - 1 浓度劣等 1 天和第 3 天的细胞数目。进行双因素方差分析，列因素（浓度）在每个时刻点的均值之间无显耀各别（p = 0.5308），行因素（时刻点）的均值之间有显耀各别（p < 0.0001），交互项 p = 0.6731。使用 Tukey 多重比较锻真金不怕火比较每个浓度下的不同时间点。通盘三种浓度在第 3 天与第 0 天和第 1 天比较，细胞数目均显耀加多。

四、揣测

电纺支架是再生医学中已知的材料，因为它们访佛于细胞外基质。在这些方法中，材料具有高度多孔性、生物相容性，而且大致负载助长因子。电纺的一个优点是不同材料不错很容易地组合在肃清植入物中。合成团聚物频繁被使用，因为其物感性质已被充分表征，而且大多不错轻率调整。电纺的上风还在于它与不同团聚物兼容，不错制造纳米纤维，具有高形状积与体积比，而且易于操作。其谬误是使用高电压和溶剂，这些可能有毒，但却是坐褥所必需的。不同的团聚物，如胶原卵白、聚氧化乙烯（PEO）、聚己内酯（PCL）等具有高生物相容性的材料，被用于不同的愚弄，如组织再生或骨骼肌再生。

揣测东谈主员调整肌腱断裂的方法是使用电纺管，将其扬弃在断裂并缝合的肌腱上。通过在支架中掺入 PDGF - BB 和 IGF - 1，期许进一步促进愈合经过。由于将助长因子掺入材料本人，大致已毕更徐徐和雄厚的开释。

01. 最伏击的发现

本论文的主要策动是制备具有不同层且掺入不同助长因子（即 IGF - 1 和 PDGF - BB）的 DP15 管，这一策动已已毕。此外，揣测东谈主员大致表征一种管，其在 4 小时后具有 PDGF - BB 和 IGF - 1 的爆发式开释，随后是长达 42 天的徐徐雄厚开释。而且，管的层厚度为 147.49μm（±43.40），相配适当植入大鼠跟腱。DSC 被解说是检测支架中残留 PEG 的有劲用具，这标明从金属棒上取下管子后进行洗涤对于取得纯支架至关伏击。终末，用 1 ng/mL 的 IGF - 1 补充兔跟腱腱细胞，在第 3 天导致 Col1 的相对基因抒发加多。在 1 ng/mL 的浓度下，与更高浓度（如 10 和 100 ng/mL）的 IGF - 1 比较，腱调卵白和 ki - 67 的抒发在第 3 天也有所加多。

02. 电纺

电纺支架正常具有大孔隙率、不同大小的单个孔隙、从纳米到微米的单个纤维以及高形状积与体积比的脾性。好多因素会影响电纺样品取得合适的纤维和层厚度。在本揣测中，电纺样品的结构是管，其主义是扬弃在断裂并缝合的肌腱上，匡助愈合经过并细心粘连形成。先前的揣测还是标明 DP 管具有积极作用。

采选氯仿行为主要溶剂，因为 DP 可溶于氯仿，且其沸点为 61.2°C，较低，在电纺经过中溶剂容易挥发。采选 HFP 行为第二种溶剂，其沸点为 59°C。低沸点溶剂存在堵塞的问题，但在制备揣测东谈主员的管子时并未出现此问题。溶液的流动性足以幸免在纺丝头或特氟龙软管内堵塞，而且在合适的职责距离下，溶剂在电纺经过中仍能正常挥发。有揣测标明，电纺溶液中团聚物的浓度会更正纤维的形态，当团聚物浓渡过高时，可能会形成珠子和团块；违抗，另一项揣测报谈，由于团聚物浓度低导致的低粘度，可能会导致静电喷雾，产生液滴而不是纤维。在 DP 上的揣测还是标明，加多职责距离会导致纤维厚度减小和罗列加多，加多流速或阻挡汇集器速率会使纤维厚度加多。在分段聚氨酯（SPU）上，揣测东谈主员得到了不同的结果，更大的职责距离、更高的流速和更高的团聚物浓度会导致纤维直径增大。此外，电压也有额外的影响，当电压相配高（30 kV）时，纤维直径会从小到大都有。揣测东谈主员采选的参数是基于该界限之前的实验。设定 18.5 cm 的职责距离，这被合计是一个平均距离；采选 1 ml/min 的流速，该流速较低，应会减小纤维厚度，因为溶液流动性较好；12.5 kV 的电压似乎是笔据 SPU 揣测创建沟通尺寸纤维的理念念电压。预期纤维厚度的漫衍会愈加均匀，但本色存在各别，这可能是由于职责距离、流速等参数未按照揣测提倡设立一致。500 rpm 的汇集器速率也被合计较低，应会导致纤维厚度加多以进行赔偿。较低的汇集器速率会导致纤维立地漫衍，这是期许的，因为这种形态下，弹性在轴向和横向方进取漫衍更均匀（图 12）。机械测量仍然露馅轴向和横向拉伸之间存在各别，但如果纤维更平行，纤维方进取的杨氏模量会比横向方进取的杨氏模量显耀加多。

03. Degrapol 管的表征

0301.SEM

对不同形状进行了 SEM 成像。在管的内形状，即光滑形状，单个纤维判辨可见，纤维顶部扁平，这是由于其平直附着在金属棒上。即使在 DP 和金属棒之间有一层相配薄的 PEG，形状仍然是扁平的。这种纤维的扁平化使得永诀不同形状变得容易。比较之下，外在面彰着更简略，惟恐甚而有一些积蓄的 DP 材料液滴。由于该形状扬弃在肌腱上，其结构有助于在不进一步缝合的情况下将管固定在位。切割部位和断裂部位之间的各别也很彰着。由于切割时用手术刀施加的力，单个纤维粘在一齐，形成了一个险些均匀的层，无法永诀单个纤维。在断裂管子时，管子被冷冻且相配脆，用两个镊子撅断时，会沿着单个纤维分裂，这么就不错看到 DP 管的里面结构。断裂产生的结构对于测量管的层厚度和单个纤维的厚度很伏击。

0302.FTIR

FTIR 是分析不同材料的有用方法，分析速率快、准确性高且相对灵巧。将红外辐射愚弄于物资，不同的键会脱手振动，产生特定的能量传输，可在光谱中检测并露馅出来。在本揣测中，使用的是 600 cm⁻¹ 至 4000 cm⁻¹ 的中红外光谱。在通盘 DP 支架的光谱中，1722 cm⁻¹ 处的峰位于红外光谱的双键区域，是通盘峰中最突出的。该峰对应于羰基（C=O）的存在，羰基是 DP 中酯键的一部分，因此是这种聚酯中最常见的键。1175 cm⁻¹ 处的第二个峰及周围峰露馅了酯（C - O）的对称和分歧称振动。3380 cm⁻¹ 处的峰与 N - H 拉伸联系，与其他峰比较相对较小。大多数其他峰对应于不同类型的 C - H 键。PEG 的特征峰位于 1095 cm⁻¹ 处，对应于 C - O 键的分歧称拉伸，代表 PEG 链中的 C - O - C 醚键。通盘这些峰与之前对于 DP 和 PEG/PEO 的揣测一致。在 DP 和 PEG 的光谱中，都有一个在 2365 cm⁻¹ 和 2330cm⁻¹处的双峰，对应于CO2的键合 。正如预期的那样，光谱之间莫得彰着的可见各别。不同 DP 块状材料的光谱（图 14A）、不同洗涤方法的光谱（图 15A）以及不同管类型的光谱（图 16A）都莫得露馅出彰着各别。有揣测报谈了使用 FTIR 对 PEG 化进行分析 ，PEG 中的 C - O - C 键在 DP 中也存在，因此用揣测东谈主员的方法无法永诀含有或不含有残留 PEG 的 DP 样品。FTIR 也无法检测到小数的助长因子。但是，在比较 C=O 与 C - O 峰的比率时，存在显耀各别。弹性较低的材料 DP0 和 DP30 具有较高的 C=O 与 C - O 比率（图 17），这是由不同 DP 类型的组成形成的；DP0 和 DP30 的弹性部分较少，这可能导致 C - O 振动较少。正如预期的那样，通盘含有新弹性 DP15 的样品的比率莫得显耀各别。

0303.DSC

DSC 是一种测量与热流联系脾性的仪器。它不错测量样品的物感性质随温度随时刻的变化。当热活动结巴稳态时，热谱图中就会出现一个峰。峰的最高温度（(T p)），惟恐也称为热更动温度（Tt）、更动中点（(T m )） 或熔点，被界说为与基线各别最大的温度。DSC 用于比较不同的块状材料（图 14B）、不同的洗涤方法（图 15B）和不同的管类型（图 16B）。通盘由 DP 组成的样品的T m都在相似的范围内，约为 135°C，而 PEG 的T m约为 55°C。

当无定形部分和结晶部分的材料交融形成熔体时，就达到了玻璃化更动温度。玻璃化更动点出当今存在无定形材料的情况下。除了 PEG，通盘测试材料的玻璃化更动温度(T g ) 都在沟通的范围内，相变焓亦然如斯。FTIR 无法露馅的一个发现是，一些管子仍然含有残留的 PEG，这在 DSC 图中发达为在约 55°C 处的一个小峰，这个温度是 PEG 发生相变的温度。在Tm时，一半的物资仍处于正常状态，50% 处于变性状态。在文件中，PEG 的熔点笔据分子量的不同，界说在 40°C 到 71.1°C 之间。对于分子量为 35 kDA 的 PEG，在第二个加热轮回中熔点为 68.3°C。相变焓跟着分子量和熔点的加多而加多。在图 15B 中，PEG 在 55°C 处有一个大峰，正常洗涤管中有一个小峰，额外洗涤管中险些看不到峰，而 DP 块状材料中王人备莫得峰，这些峰高的各别判辨可见。当比较不同的管子时（图 16B），一些管子在约 55°C 处的小峰与正常洗涤方法相对应。经过额外洗涤的管子中莫得这些峰。在另一项揣测中 ，在 0.1% BSA 的 PBS 中开释 30 天后，一些残留 PEG 的影响减小，这与进一步洗涤对 PEG 的影响访佛。通过更好的洗涤或开释经过，PEG 会融化，不会在 DSC 图中露馅出来。不同的块状材料（图 14B）在相变焓方面存在各别。在弹性较低的材料（DP0 和 DP30）中，不错看到两个相变峰，而在 DP15 材料中只露馅一个峰。这一定是由于不同材料中弹性与非弹性部分的比例不同。正常，两个峰标明存在两种不同的晶体形态，也有可能是存在一些杂质，对于大分子来说，这可能是由于分子量的漫衍或晶体片层厚度的漫衍形成的。实验中使用的氯仿和 HFP 等溶剂行为杂质不错在此处排斥，因为这些溶剂正常会在第一个加热轮回中挥发，不会在仅用于分析的第二个加热轮回中出现。相变的肇端温度仍然在沟通的范围内。

0304.静态水构兵角

为了比较水构兵角（β），在管的内形状滴一滴水，这是更光滑的形状，在植入肌腱周围时会面向周围组织。预期该形状是疏水的，从 DP15 与 IGF - 1 的结果来看亦然如斯。当 β 大于 90° 时，形状被合计是疏水的。水点放在形状时会形成，但跟着时刻推移会变平，这标明水正在浸透到支架中。DP15 与 IGF - 1 的组合被合计是疏水的，因为其平均水构兵角为 114.9°（± 3.9°），大于 90°。纯 DP 被合计是稍稍亲水的，因为其水构兵角为 88.9°（± 2.97°），与 90° 仅收支很小。这个结果与管子的光学外不雅相符。诚然莫得进行测试，但从 SEM 图片中不错看出，IGF - 1 的形状孔隙较少，标明其疏水性更高。跟着时刻推移，水点变平亦然预期的，因为揣测东谈主员的支架是多孔的，水会参加孔隙，使运行水点变小并变平，导致 α 增大，从而使水构兵角（β）阻挡。有揣测报谈，简略的形状会增强疏水性。愚弄到本揣测中，对于多孔材料，更简略的单个纤维可能会导致更高的疏水性。纤维的简略度不错通过在溶液中使用不同分量百分比的团聚物来更正，而且在电纺经过中，内层的纤维由于被压在金属棒上而更光滑。接头到管的外在面，其单个纤维的简略度与内层不同，这不错在进一步的实验中进行揣测。在一项揣测中，也测量了纯 DP 和含有 FITCBSA 的乳液的水构兵角。测量的角度相似，范围从 104.61° ± 1.49° 到 124.86° ± 2.87°。对于纯 DP，揣测东谈主员得到的 88.9° ± 2.97° 的结果不在这个范围内。但是，乳液电纺的水构兵角与之前的揣测在肃清范围内。由于在揣测东谈主员的揣测中不判辨是在支架的哪一侧测量水构兵角，是以这种各别不错得到解释。

04. 机械测试

DP 管的机械性能不错通过应力 - 应变弧线来笃定。这么的弧线由三个阶段组成：肇端阶段、线性阶段和失效区域。应力（也被视为施加的载荷）与应变（视为伸长）绘图在一齐。线性区域的斜率是代表材料脾性最常用的参数，称为杨氏模量。在揣测东谈主员的实验中，杨氏模量界说为应力 - 应变弧线中应变达到 20% 之前的线性部分。与肌腱比较，揣测东谈主员的管子的杨氏模量要小得多，但由于它仅仅愚弄在肌腱之上，是以这还是足够了。对于纯 DP 和乳液 DP 两种样品，轴向所在更雄厚，这是合理的，因为管中的单个纤维在轴向所在形成凹槽，有助于管的雄厚。特地是在含有 IGF - 1 的 DP 中，轴向和横向所在的各别很大。这亦然预期的，因为含有 IGF - 1 的样品中凹槽形成特地彰着。横向和环形结构露馅出相似的结果，这是预期的，因为它们具有沟通的拉伸所在。样品笔据横截面积进行了标准化，这意味着环形结构本人对机械性能莫得影响。拉伸实验标明，环形所在的断裂应变仅略高于横向所在。细密的一致性标明夹紧引起的应力聚会不应是问题。正如在含有 PDGF - BB 的 DP 中还是看到的那样 ，机械性能是各向异性的，死守沟通的趋势。轴向所在的极限拉伸应力和伸长率比横向所在大。含有 IGF - 1 的乳液电纺管的机械性能结果与之前对于含有 PDGF - BB 的访佛管的揣测结果相似。

在另一项对于 PLGA 和聚（L - 乳酸）（PLLA）的揣测中 ，揣测东谈主员发现向纺丝溶液中添加卵白质会更正机械性能。含有卵白质的支架的极限拉伸应力和断裂应变阻挡。在揣测东谈主员的实验中，含有 IGF - 1 的 DP 支架的极限拉伸应力、断裂应变和杨氏模量反而加多。这种违抗的结果可能来自于管形状的形态：与纯 DP 支架比较，含有 IGF - 1 的管形成了更多的凹槽，这似乎加多了机械性能。进一步的发现是，险些通盘的样品都在中间扯破，而不是在夹子附着在支架的部位扯破。因此，材料性能得到了稳当的体现。

05. 生物膜

细菌等微生物很容易附着在不同的形状并形成生物膜，生物膜不错保护细菌 。因此，揣测东谈主员的支架不促进生物膜形成相配伏击。行为第一步，支架用紫外线映照 30 分钟进行灭菌。揣测标明，紫外线灭菌对 PLGA 支架的断裂应变、杨氏模量和极限拉伸应力有隐微的阻挡作用 。30 分钟的紫外线灭菌对物理化学脾性和形态莫得影响，PDGF - BB 的开释减少，但 PDGF - BB 的生物活性不受影响。采选紫外线灭菌是因为用抗生素灭菌会对细菌的助长和存活产生平直的负面影响。揣测东谈主员也接头过像之前体内实验那样在 37°C 下用环氧乙烷气体灭菌 4.5 小时 ，但由于时刻原因以及为了使通盘管子的生物膜形成具有可比性，最终采选了紫外线灭菌。笔据一项对于访佛支架的揣测 ，对纯 DP 管和含有 IGF - 1 的 DP 管测试了全部 10 种细菌菌株。对于浸入银溶液的管子，只使用了四种临床分离菌株，因为这些菌株在纯 DP 和含有 IGF - 1 的 DP 之间莫得露馅出显耀各别。临床分离菌株的上风在于使用它们不错普及揣测结果的转动价值，因为这些分离株会在东谈主体中引起与异物（如植入物或导管）联系的感染。实验室菌株在东谈主体中的作用被怀疑与在体外不同。由于银具有抗菌脾性 ，揣测东谈主员期许通过添加银，细菌在这些菌株上的粘附会比其他菌株低。当比较纯 DP、含有 IGF - 1 的 DP 和浸入银的 DP 时，莫得露馅出显耀各别。PA 是独一的革兰氏阴性细菌菌株，在这种菌株中，银的抗菌作用似乎比其他菌株更彰着。革兰氏阴性细菌有一层薄的肽聚糖，周围环绕着外膜，而革兰氏阳性细菌只消一层较厚的肽聚糖 ，因此形状结构不同。在之前的一项揣测中，揣测东谈主员发现银对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都有抗菌作用。银纳米颗粒的抗菌结果高度依赖于其大小。有可能较小的颗粒尺寸会加多对细菌菌株的抗菌结果。由于支架仅仅形状涂有银，这种结果可能会松开，因为银可能在实验早期就被洗掉了。如果将银纳米颗粒像 IGF - 1 一样乳化到 DP 溶液中，不雅察其结果会很兴趣。从植入材料中徐徐开释银可能会有更彰着的抗菌结果。揣测标明，愚弄的银纳米颗粒浓度对不同类型细菌的助长会产生不同的影响。

总体而言，揣测东谈主员瞻望在细菌欺侮的情况下，通盘细菌菌株都会在揣测东谈主员的支架上形成生物膜，因为它是一种多孔的电纺材料，在结构上与细胞外基质有一些相似之处。通盘菌株都以不同进程附着在 DP 支架上，但笔据之前访佛的揣测 ，对于这类样品，这个附着量在预期范围内。这些结果标明，揣测东谈主员需要合适的灭菌和无菌植入条目来减少细菌的附着并阻挡感染风险。在揣测东谈主员实验室正在进行的实验中，一项实验标明，在兔子跟腱体内植入含有透明质酸的 DP 管后莫得细菌定植。这标明所使用的灭菌方法（环氧乙烷）足以细心生物膜形成的加多。

06. 支架中助长因子的开释

对于乳化在 DP15 支架中的 IGF - 1，揣测东谈主员进行了不同 RSA 浓度和储存方法的开释能源学实验。开释能源学很伏击，因为使用不同分子量、雄厚性和组成的助长因子时，这个参数可能会有很大各别。在之前的一项揣测中 ，8μg 的 PDGF - BB 与 0.1% 的 RSA 搀和以雄厚 PDGF - BB，并掺入到 5g 的 DP15 溶液中。由于 IGF - 1 的分子量比 PDGF - BB 低，揣测东谈主员合计其开释会更快、更有用，是以只使用了一半量的 IGF - 1（4μg）。图 21 中的开释能源学露馅了用于雄厚 IGF - 1 的三种不同 RSA 浓度。更多的载体卵白 RSA 应该会使 IGF - 1 在管内更雄厚，并导致更徐徐、雄厚的开释。结果标明，通盘三种管子都有徐徐、雄厚的开释。

只消 0.1% RSA 的管子累积开释量最低，在运行爆发开释后，与含有 0.25% 或 0.5% RSA 的管子比较，后续几天开释的量很少。由于 0.25% RSA 的管子在四天内的累积开释量最高（9.2 ng/mL ± 1 ng/mL），它似乎是保执助长因子好意思满的最有用条目。0.1%（1.2 ng/mL ± 0.9 ng/mL）的管子和 0.5%（1.7 ng/mL ±0.2 ng/mL）的管子在 1 小时后的 IGF1 开释量相似，但对于 0.5% 的管子，第 1 天的开释量接续以相似的量加多，而 0.1% 的管子在 1 小时后的通盘时刻点开释量都相配徐徐。0.1% RSA 的管子在第 5 天的累积开释量比 0.25% RSA 的管子在第 4 天的累积开释量低 4.8 倍。0.25% RSA 的管子的开释量比 0.5% RSA 的管子高 1.5 倍。总之，RSA 的量只可在一定浓度范围内改善开释能源学。0.5% RSA 被合计还是过高，它使 IGF - 1 在管内过于雄厚，从而不成有用地开释。有可能在更长的开释时刻内，会有更多的 IGF - 1 开释出来。由于揣测东谈主员的策动是使 IGF - 1 主要在肌腱愈合的前四到七天开释，以协同援手 PDGF - BB 的作用，是以 IGF - 1 在管内长时刻王人备保留是不利的。

对于揣测东谈主员念念要已毕的现成家具来说，存储植入材料的智力是必不可少的。植入物大致易于存储相配伏击。在揣测中，揣测东谈主员测试了在室温下存储这种最圣洁的存储方式，以及在 - 20°C 下存储。揣测东谈主员的策动是制备一种含有助长因子的管，在坐褥后不错存储直到植入。对于这扶植入材料的永远存储，所掺入的助长因子的雄厚性需要很高。但管内的雄厚性又不成过高，因为助长因子也需要开释出来。揣测东谈主员的发现标明，存储 10 个月后，IGF - 1 的开释量会下落。

揣测东谈主员对含有 PDGF - BB 或抗坏血酸的 DP 支架也进行了相应的存储实验。样品在室温、+4°C 和 - 20°C 下存储 1 周 。在揣测东谈主员的揣测中，崭新样品的累积开释量最高（36 ng/mL ± 7.2 ng/mL），而在 - 20°C（13.7 ng/mL ± 2.2 ng/mL）和室温（3.5 ng/mL ± 1.6 ng/mL）下存储的样品累积开释量较低。这些结果与抗坏血酸的结果一致，但与 PDGF - BB 的结果不一致。不同的结果可能是由于存储时刻或助长因子的类型形成的。助长因子和支架随时刻的雄厚性起着主要作用。揣测东谈主员的揣测结果是合理的，因为 IGF - 1 的雄厚性有限，随时刻的降解导致 IGF - 1 减少，这在开释能源学中不错彰着看出。IGF - 1 在室温下的降解比在 - 20°C 下更快，这通过比较 10 个月后的相应开释能源学得到了阐明（图 22）。

当平直比较肃清根管中 IGF - 1 和 PDGF - BB 的开释时，IGF - 1 的累积开释量高于 PDGF - BB，尽管电纺到管中的 PDGF - BB 总量是 IGF - 1 的两倍。管的组成是，第一层为纯 DP15，接着是一层乳化有 IGF - 1 的 DP15，终末是一层含有 PDGF - BB 的 DP15。因此，PDGF - BB 比 IGF - 1 更接近形状和开释介质。IGF - 1 层的电纺时刻为 15 分钟，PDGF - BB 层为 25 分钟，但这并不成解释 IGF - 1 开释量更高的景色。IGF - 1 累积开释量更高可能是由于两种助长因子的分子量不同。IGF - 1 的分子量为 7.6 kDa，是 PDGF - BB（24.3 kDa）的 3.2 倍小。在第 4 天，IGF - 1 的累积开释量为 1660 pg/mL（± 892 pg/mL），而 PDGF - BB 为 566 pg/mL（± 213 pg/mL），后者比前者少 2.9 倍。与之前对于乳液电纺 DP15 管中 PDGF - BB 开释的揣测比较 ，本揣测中 PDGF - BB 的开释量低 5 倍。由于不判辨之前揣测中的电纺时刻和管的长度，是以无法平直进行比较。但是，它们都在 500 - 3500 pg/mL 的范围内。由于在电纺经过中部分溶液会失掉且无法精准量化，是以无法准确预计有若干助长因子掺入到一定量的管中。笔据揣测东谈主员的生物活性测定结果，1 ng/mL 的 IGF - 1 似乎对基因抒发有最大的积极影响，是以在第 42 天，1.66 ng/mL（± 0.89 ng/mL）的 IGF - 1 累积开释量似乎也足以对腱细胞的基因抒发产生积极影响。

在电纺和存储经过中，助长因子的雄厚性可能会因构兵不同溶剂、超声处理导致溶液温度升高以及高电压等因素而阻挡。揣测标明，像东谈主 β - 神经助长因子 、或 PDGF - BB 在电纺经过中会部分丧失生物活性。在本揣测中，电纺经过似乎对卵白质雄厚性莫得很大的负面影响，因为不错检测到 IGF - 1 的开释。但是，存储的影响似乎更大，因为在两种存储方法下，经过 10 个月的存储，通过 ELISA 检测到的 IGF - 1 含量都有所下落。电纺和存储后 IGF - 1 的生物活性仍需进一步评估。

07. 生物活性

之前一项对于兔跟腱腱细胞在 25 ng/ml PDGF - BB 作用下肌腱标记物基因抒发的揣测标明，在 3 天、7 天和 14 天后，Col1 或腱调卵白的抒发莫得显耀变化。增殖标记物 ki - 67 在第 3 天抒发较高，但随后下调。在本揣测中使用 IGF - 1 进行实验时，当愚弄低浓度的 IGF - 1 时，不雅察到 ki67 有访佛的趋势，这标明在第 3 天，1 ng/ml 的 IGF - 1 能促进兔跟腱腱细胞的增殖（图 24）。在第 1 天，与 0 ng/ml 比较，1 ng/ml 和 100 ng/ml 的 IGF - 1 能加多 Col1 的基因抒发。在第 3 天，1 ng/ml 的 IGF - 1 使 Col1 的抒发进一步加多，而 100 ng/ml 的 IGF - 1 则使其显耀下调。在第 1 天，通盘浓度下腱调卵白的抒发都较低，但仍能检测到显耀各别。在第 3 天，与其他样品比较，1 ng/ml 的 IGF - 1 使该标记物的抒发显耀上调。总体而言，在第 3 天，1 ng/ml 的 IGF - 1 能显耀加多通盘三种标记物的抒发。这标明低浓度似乎有益于肌腱愈合，而高浓度则莫得或只消较小的促进作用。在进一步的实验中，揣测更长时刻内的作用结果将很兴趣。将 PDGF - BB 和 IGF - 1 联接在肃清根管中似乎是一种有远景的方法。ki - 67 在 PDGF - BB 和 IGF - 1 作用劣等 3 天的基因抒发都有所加多，因此两种助长因子的组合可能会产生更强的结果。两种助长因子的组合也可能会延长增殖期，这在肌腱愈合的增殖阶段是有匡助的。在这个阶段，腱细胞主要用 III 型胶原卵白构建基质，肌腱肿胀，含有大批的水和卵白聚糖。如在犬屈肌腱中所示，单独使用 PDGF - BB 可改善肌腱的滑动，这可能是因为 PDGF - BB 促进了透明质酸的产生，有助于滑动。在另一项揣测中，揣测东谈主员发现 PDGF - BB 可加多细胞密度、Col1 mRNA 抒发和细胞增殖，从而可能促进肌腱愈合。当 PDGF - BB 与 IGF - 1 联接时，可促进胶原卵白合成。联接 IGF - 1 在早期能加多 Col1 抒发的脾性，DP 乳液管可能会进一步促进细胞增殖和基质合成，并在愈合后普及拉伸强度，这将在改日进行测试。

阿拉玛蓝实验是一种熟悉的氧化还原指令剂，用于检测细胞代谢功能和细胞健康现象。该实验的旨趣是引入一种蓝色的非荧光染料刃天青，它可被代谢活跃的细胞还原为红色且具有高荧光性的试卤灵。当细胞代谢活跃时，还原经过会加速，荧光输出与活细胞数目成正比。由此不错推断，在通盘浓度下，活细胞数目在一段时刻内的加多量是沟通的（图 25）。揣测东谈主员发现，从第 0 天和第 1 天到第 3 天，细胞数目显耀加多。不相似品之间莫得显耀各别，这标明 IGF - 1 对细胞代谢莫得影响。正如预期的那样，通盘浓度下的活细胞数目在三天内都在加多。

为了久了了解 DP 管开释的 IGF - 1，对这些样品进行沟通的实验将很有兴趣。由于开释的样品浓度不高，需要先进行浓缩。但由于枯竭联系材料，对这些样品的检测仍有待进行，并将在改日的实验中完成。

08. 揣测的伏击性

通过使用本论文中通盘的方法对植入物进行表征，揣测东谈主员加深了对该系统的融会，这些结果可用于坐褥不同直径的管子，以适配任何肌腱尺寸。此外，揣测东谈主员为进一步开展动物推行奠定了基础，以援手电纺 DP15 管在调整肌腱断裂方面的愚弄。开释结果标明，针对 PDGF - BB 和 IGF - 1 使用不同的 RSA 浓度似乎是保执它们雄厚性的有用方法，在将其他助长因子愚弄于这类支架时也应试虑这一丝。生物膜实考解说，细密的灭菌对于扼制细菌助长是必要的。存储结果标明，存储会使 IGF - 1 浓度阻挡，但在 - 20°C 下存储比在室温下落低的进程要小。由于揣测东谈主员的策动是开发一种现成的家具，这方面还需要进一步优化。

09. 局限性

小样本量使得并非通盘实验都能得出具有统计学兴趣的结果，但由于当前线法已王人备建立，加多样本量很容易已毕。受限于平正的电纺开采，一些因素难以限度，使用更先进的开采不错改善这一情况。缺憾的是，在 qPCR 和阿拉玛蓝实验中，揣测莫得使用来自多个供体的兔跟腱腱细胞，不外在后续实验中将会加多供体数目。尽管如斯，本论文仍为改日的实验提供了坚实的基础。

10. 论断

要而论之，在本论文揣测经过中，生效制备并充分表征了含有 IGF - 1、PDGF - BB 以及同期含有两种助长因子的乳液电纺 DP 管，这些管可用于体内实验。它们都露馅出相应助长因子的运行爆发式开释，随后是徐徐而雄厚的开释。IGF - 1 对细胞代谢莫得负面影响，而且在低浓度愚弄于腱细胞时，能加多伏击的腱细胞标记物的抒发。通过乳液电纺掺入助长因子不会损害机械性能，反而增强了机械性能。揣测东谈主员还发现，乳液和纯支架上都可能形成生物膜。乳液 DP 的疏水性高于纯 DP。通过 FTIR 和 DSC 检测，乳液和纯 DP 支架之间莫得彰着各别。DSC 大致检测到残留的 PEG，而 FTIR 则无法作念到。笔据 DSC 结果，揣测东谈主员大致确保对管子的洗涤达到了去除通盘残留 PEG 的预期结果。这么，含有掺入助长因子的生物活性管已准备好植入改日的动物模子中，以测试其在肌腱断裂树立中的功能。

附录

01. 肌腱雄厚材料上的生物膜实验决议

0101.D - 2

从 - 80°C 的菌种库中取出细菌菌株，在哥伦比亚血琼脂平板上划线，于 37°C 孵育 18 小时。

0102.D- 1

①进行过夜培养准备，从琼脂平板上挑取多个单菌落，接种到 15ml 细菌管中的 5ml 胰卵白胨大豆肉汤（TSB）中。

②在 37°C、220rpm 的条目下孵育 16 小时。

0103.D 0

①将过夜培养物在 5ml 崭新 TSB 中按 1:25 稀释，于 37°C、220rpm 孵育 45 分钟。

②将细菌管在 4000rpm 下离心 10 分钟，弃去上清液。

③将细菌千里淀重悬于 1ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。

④在崭新 PBS 中周折至光密度（OD）为 0.5。

⑤将 OD 为 0.5 的细菌在所需培养基（Ham's F12 + 10% BSA 或 RPMI + 10% FCS）中按 1:200 稀释。

⑥向含有肌腱材料的 96 孔板的每个孔中加入 200μl 制备好的细菌悬液。

⑦将平板在 37°C 的湿盒中静态孵育所需时刻（1 小时和 24 小时）。

0104.时刻点操作：

①取出培养基，将肌腱材料移动到新的孔中。

②用 200μl PBS 洗涤 2 次，然后向孔中加入 200μl PBS，用 parafilm 密封平板，在超声波水浴中超声处理 1 分钟。

③汇集 200μl PBS 并移动到 96 孔稀释板中。

④进行 10 倍系列稀释（即 25μl 细菌悬液加入到 225μl PBS 中）。

⑤将每个稀释度的 25μl 溶液滴加到琼脂平板上，每个稀释度滴 3 次。

⑥将平板在 37°C 孵育 18 小时，然后计数菌落。

02. ELISA 检测 IGF - 1 的实验决议

使用前，将通盘材料和制备好的试剂均衡至室温（18 - 25°C）。提倡对通盘标准品、对照品和样品进行双份检测。

①按照阐述准备通盘试剂、标准溶液和样品。使用前将试剂均衡至室温。实验在室温（18 - 25°C）下进行。

②从板框中取出满盈的微孔板条，立即放回装有干燥剂的铝箔袋中，密封好袋子以尽量减少与水蒸气的构兵，并储存在真空干燥器中。

③每孔加入 50μL 胰岛素样助长因子 1 标准品或样品。用密封胶带遮盖孔板，孵育 2 小时。终末一个样品加入后脱手计时。

④手动用 200μL 1X 洗涤缓冲液洗涤 5 次。每次洗涤时将板非常并倒掉液体，在吸水纸上轻拍 4 - 5 次以王人备去除液体。如果使用洗板机，则用 300μL 1X 洗涤缓冲液洗涤 6 次，然后非常板，倒掉液体，在吸水纸上轻拍 4 - 5 次以王人备去除液体。

⑤每孔加入 50μl 1X 生物素化胰岛素样助长因子 1 抗体，孵育 2 小时。

⑥按上述方法洗涤微孔板。

⑦每孔加入 50μl 1X SP 联接物，孵育 30 分钟。提前翻开微孔板读数仪并设立好次第。

⑧按上述方法洗涤微孔板。

⑨每孔加入 50μl 显色底物，孵育约 25 分钟或直至出现最好蓝色密度。轻轻敲击板以确保充分搀和，并用移液器吸头冲破孔中的气泡。

⑩每孔加入 50μl 终止液。方式将从蓝色变为黄色。

⑪立即在微孔板读数仪上于 450nm 波所长读取吸光度。如果有波长雠校功能，从 450nm 处的读数中减去 570nm 处的读数以雠校光学颓势。不然，仅在 450nm 处读取板。请留心，在终止反应约 10 分钟后，高浓度点可能会产生一些不雄厚的玄色颗粒，这会阻挡读数。

谋划：谋划每个标准品和样品的三次重迭读数的平均值。为生成标准弧线，以标准品浓度为横坐标，相应的 450nm 吸光度平均值为纵坐标绘图图表。通过追想分析，使用对数 - 对数或四参数逻辑弧线拟合来笃定最好拟合线。从标准弧线中笃定未知样品的浓度，并乘以稀释因子。

03. ELISA 检测 PDGF - BB 的实验决议

使用前，将通盘试剂在室温下均衡 20 - 30 分钟。（标准品、检测抗体和 HRP 联接抗体由于每次使用量较少，可平直使用）

①按照阐述准备通盘试剂、样品和职责标准品。（见第三节 1 样品制备和第三节 2 试剂制备（包括标准品制备））

②取出所需数目的微孔板条，将微孔放入条架中。同期，将满盈的板条放回含有干燥试剂包的铝箔袋中并从新密封，立即储存在 4°C。微孔板条应尽快使用。

③向相应的孔中加入 100μl 每种标准品和样品。（确保样品添加经过不拆开，并在 5 - 10 分钟内完成）

④用封板膜密封板，使劲按压使其紧贴微孔顶部。将板在 37°C 的湿气环境中孵育 1 或 2 小时。（具体孵育时刻见单个试剂盒阐述书）

⑤洗涤孔：

a. 轻轻取下封板膜。

b. 通过吸取或倒掉的方式弃去孔中的液体。

c. 在崭新的纸巾上轻拍板几次，去除任何残留溶液。

d. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔至少使用 300μl。终末一次洗涤后，在崭新的纸巾上使劲轻拍板 10 次，去除残留的洗涤缓冲液。留心幸免纸巾纤维参加孔中或使孔王人备干燥。

⑥每孔加入 100μl 1X 检测抗体溶液（见第三节 2 试剂制备）。用封板膜密封板，在 37°C 的湿气环境中孵育 1 小时。重迭设施 5 中的洗涤操作。

⑦每孔加入 100μl 1X HRP 联接抗体。用封板膜密封板，在 37°C 的湿气环境中孵育 40 分钟。重迭设施 5 中的洗涤操作。显色：每孔加入 100μl TMB 底物溶液。在 37°C 阴暗中孵育 15 - 20 分钟。阳性反应将露馅为蓝色。（如果蓝色出现得太淡，提倡延长孵育时刻）

⑧终止显色：按添加 TMB 底物的沟通礼貌向每孔加入 100μl 终止液。轻轻敲击板的侧面使其搀和。方式将从蓝色变为黄色。

⑨读取结果：加入终止液后立即在微孔板读数仪上于 450nm 波所长读取吸光度。如果可能，进行双波长读数（450nm 和 630nm）。加入终止液后应立即测量吸光度，不要跳跃 5 分钟。

⑩谋划：对每个标准品和样品的双份读数取平均值，并减去平均零标准吸光度（从 “sd0” 读数的平均值取得）。通过追想分析，使用四参数逻辑弧线拟合（4 - PL）笃定最好拟合标准弧线。行为替代方法，不错以每个标准品的平均吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘图标准弧线，并通过图中的点绘图最好拟合弧线。也不错通过绘图标准品浓度的对数与 OD 读数的对数来使数据线性化，通过追想分析笃定最好拟合线。这种方法将产生一个足够但不太精准的数据拟合。

04. 单元面积分量的方差分析表

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